ANALIZA DNA W ARCHEOLOGIIANALIZA DNA W ARCHEOLOGII, Swiat Nauki, Genetyka
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
dr Paweł Golik dr Ana Stanković mgr Mateusz Baca mgr Hanna Panagiotopoulou Analiza naturalnych populacji – ekologia molekularna. Analiza DNA w archeologii. Genetyka w kryminalistyce. Nawiązując do poprzednich ćwiczeń, na których była mowa o mitochondrialnym DNA i jego użyciu jako markera przy ustalaniu różnych chorób genetycznych, chcielibyśmy również przedstawić pojęcie markera genetycznego. Omówimy wykorzystywanie markerów genetycznych w różnych dyscyplinach: genetyce populacji, genetyce ochronnej, archeologii i kryminalistyce. Marker genetyczny Markerem genetycznym nazywamy każdą sekwencję nukleotydową, której polimorfizm (występowanie w postaci przynajmniej dwóch łatwo rozróżnialnych alleli) pozwala na ustalanie różnic genetycznych pomiędzy osobnikami i grupami taksonomicznymi. Rodzaje markerów genetycznych SNPs (ang. single nucleotide polimorphism )– mutacje punktowe (tranzycje i transwersje) w sekwencji nukleotydowej. Zaletą ich analizy jest ich ogromna liczba w genomie - u człowieka kilka milionów. Wykrywanie SNPs opiera się na analizie hybrydyzacji z oligonukleotydami (krótkie zsyntetyzowane chemicznie jednoniciowe cząsteczki DNA (poniżej 50 bp), które będą hybrydyzowały jedynie przy pełnej komplementarności z badaną sekwencją DNA. SSLP (ang. simple sequence lenght polimorphism ) są szeregami powtórzeń sekwencji - a więc różnymi allelami zawierającymi różną liczbę jednostek powtarzalnych. Podstawą zmienności są indele (delecje lub insercje) . Aby ustalić homologię dwóch sekwencji nukleotydowych wykonujemy ich przyrównanie (uliniowanie), czyli tzw. ang. alignment) . 1 Podczas przyrównania sekwencji nie można odróżnić od siebie delecji od insercji. Nadaje im się zatem wspólną nazwę indele]. • Minisatelity-VNTR (ang. variable number of tandem repeats ) – jednostka powtarzająca się, złożona z kilkudziesięciu nukleotydów (10-100 bp). • Mikrosatelity – STR, msDNA (ang. simple tandem repeats ), czyli proste powtórzenia tandemowe, w których powtarzalny motyw złożony jest z 2 do 6 bp (np. CAAG, TGA lub CA). Typowe loci mikrosatelitarne zawierają 10-30 (maksymalnie. 50) powtórzeń motywu i osiąga długość 100 do 400 bp. Zlokalizowane są najczęściej w regionach niekodujących genomu. osobnik1 Rys 1. Budowa loci mikrosatelitarnych osobnik2 osobnik3 Powtarzaj ą cy si ę motyw np. ATCG Allele (warianty długości jednego locus ) mikrosatelitów są koodominujące i dziedziczą się w sposób mendlowski. Jeśli mamy do czynienia z 2 identycznymi allelami w locus, to taki osobnik jest dla tego locus homozygotą . Jeśli allele są różnej długości – heterozygotą . Ze względu na ich budowę, w mikrosatelitach często zachodzą mutacje. Powtórzenia tandemowe powodują, że polimeraza DNA „ślizga się” (ang. polimerase slippage ) , dodając lub opuszczając najczęściej pojedyncze powtórzenie, wydłużając lub skracając tym samym sekwencję mikrosatelitarną. Oblicza się, że częstość występowania mutacji w tych markerach u ssaków wynosi ok. 10 -2 – 10 -4 na pokolenie. Jest ona zmienna u różnych grup organizmów i wyższa u zwierząt niż u roślin. Im więcej powtórzeń znajduje się w danym allelu mikrosatelitarnym, tym większe prawdopodobieństwo jego mutacji. Stąd po pewnym czasie dla danego locus 2 (odcinka DNA) obecnych będzie wiele alleli. W związku z szybkim tempem mutacji mikrosatelity są bardzo dobrym markerem do badań populacyjnych. Replikacja Poślizg Nowy cykl replikacji + 1 motyw - 1 motyw Rys 3. Przykład poślizgu polimerazy podczas replikacji Zastosowanie badań genetycznych w ekologii Od około 20 lat techniki genetyczne są wykorzystywane w badaniach ekologicznych,. przede wszystkim do ustalania polimorfizmu genetycznego populacji. Czynniki i procesy ekologiczne determinują strukturę genetyczną . W latach 70. i 80. XX wieku badano przede wszystkim polimorfizm allozymów. W latach 90. nastąpił gwałtowny rozwój zastosowania techniki PCR i sekwencjonowania. Obecnie w badaniach populacyjnych wykorzystuje się najczęściej niekodujące sekwencje DNA, podlegające minimalnie lub wcale presji selekcyjnej (doborowi naturalnemu). Sekwencje te są z reguły wysoce polimorficzne. Należą do nich w jądrze sekwencje mikrosatelitarne (msDNA). Z sekwencji mitochondrialnych w badaniach głównie. Filogeograficznych i populacyjnych wykorzystuje się D-loop oraz cytochrom b (będący wysoce polimorficznym genem). . Informacje uzyskane w oparciu o analizę sekwencji mtDNA i msDNA wykorzystuje się w badaniach nad migracjami gatunków, określania efektywnej wielkości populacji, stopnia przepływu genów, polimorfizmu genetycznego populacji, jej heterozygotyczności, pokrewieństwa osobników, dystansu genetycznego między populacjami, przejścia populacji przez wąskie gardło itd. Pamiętać należy, że mitochondrialny DNA dziedziczy się wyłącznie w linii matczynej, w związku z czym jego analiza dostarcza informacji dotyczących jedynie części populacji (samic lub kobiet). W zależności od charakteru badań wykorzystuje się jeden lub obydwa wyżej opisane markery molekularne. 3 Genetyka ochronna (ang. Conservation genetics ). Zgodnie z powszechnie akceptowanymi zasadami ekologii na świecie, restytucję bądź ochronę gatunków powinna poprzedzać staranna analiza genetyczna, której wyniki pozwalają ocenić, czy zakres polimorfizmu genetycznego zachowanych lub introdukowanych populacji jest wystarczający dla powodzenia projektu ochronnych. Zastosowanie metod genetycznych pozwala poznać różnorodność (polimorfizm genetyczny) populacji, jak i określić przepływ genów między populacjami. Możliwe jest także ustalenie stopnia i obecności hybrydyzacji pomiędzy gatunkami autochtonicznymi a pokrewnymi, introdukowanymi przez człowieka. Wiedza ta jest niezbędna dla prawidłowej odbudowy populacji gatunku, który na danym obszarze kiedyś występował lub umożliwienie naturalnego jej odrodzenia się. Wyżej opisane działania zyskały nazwę conservation genetics – w wolnym tłumaczeniu „genetyka ochronna” (Hedrik, 2001). Genetyka ochronna to połączenie ekologii, genetyki populacyjnej, modelowania matematycznego, taksonomii i mikroewolucjonizmu. Poznanie dokładnie struktury ekologicznej i genetycznej pomaga w aktywnej ochronie gatunków. Genetyka w kryminalistyce. Identyfikacja osób i określanie pokrewieństwa. W ostatnich latach, rozwój technik izolacji DNA oraz możliwość analizy wielu loci mikrosatelitarnych jednocześnie, dostarczyła niezawodnego narzędzia do ustalania identyczności lub stopień pokrewieństwa osobników. Możliwości te wykorzystywane są dzisiaj w wielu zagadnieniach medycyny sądowej (ang. forensic science ) takich jak określanie związku pomiędzy śladami biologicznymi, identyfikacja ofiar katastrof, ustalanie ojcostwa lub pokrewieństwa dla celów spadkowych czy imigracyjnych. Identyfikacja osób – podstawy teoretyczne: Aby stwierdzić, że przykładowo, plama krwi znaleziona na miejscu morderstwa pochodzi od konkretnego podejrzanego, trzeba porównać profile mikrosatelitarne uzyskane z krwi oraz od podejrzanego. Aby uzyskane wyniki były wiarygodne i porównywalne np. pomiędzy bazami danych w różnych krajach, organizacje takie jak FBI w USA czy ISFS (ang. Intrnational Society of Forensic Science ) w Europie stworzono zestawy loci mikrosatelitarnych autosomalnych (położonych na chromosomach autosomalnych) wykorzystywane do celów identyfikacyjnych. W USA zestaw ten nazwano CODIS (ang. Co mbined D NA I dentification S ystem ) i zawiera on 13 loci: 4 • CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11 • Amelogenina – marker pozwalający na określenie płci W Europie funkcjonuje kilka systemów zawierających podobne zestawy, obejmujące tzw. ang. European Core Loci set: • FGA, TH01, VWA, D2S1338, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11 • Amelogenina Jeżeli obydwa uzyskane profile są jednakowe (tzn. posiadają identyczne allele we wszystkich loci), mamy podstawy by sądzić, że pochodzą one od jednej osoby. Jednak możliwe jest, że 2 lub więcej niespokrewnionych osób w populacji posiada taki sam profil genetyczny zupełnie przypadkowo. Prawdopodobieństwo takiego zdarzenia określane jest jako prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności (ang. match probability, mp ). Takie prawdopodobieństwo obliczane jest za każdym razem dla danego profilu genetycznego na podstawie danych populacyjnych z danego regionu. Prawdopodobieństwo przypadkowego pojawienia się danego profilu u dwóch niespokrewnionych osób w populacji zależy do ilości wykorzystanych loci oraz ich zmienności w populacji. Dla zestawu CODIS wynosi ono średnio 5 x 10 -15 a dla dostępnych komercyjnie zestawów sięga nawet 7,2 x 10 -19 . Innymi słowy oznacza to, że konkretny profil genetyczny wystąpi raz na miliony miliardów osób, a jest to liczba znacznie większa niż kiedykolwiek żyło ludzi na Ziemi. Zapewnia to prawie 100% pewność, że zgodne (identyczne) profile należą do jednej osoby. Jednak tak, jak z całkowitą pewnością można stwierdzić, że profile nie należą do tej samej osoby (nie są zgodne), tak prawdopodobieństwo, że profile pochodzą od jednej osoby nigdy nie osiąga 100%. W kryminalistyce często wykorzystuje się mikrosatelity zlokalizowane na chromosomie Y. Takie analizy wykonuje się szczególnie w przypadku przestępstw na tle seksualnym, kiedy uzyskana próbka jest mieszaniną materiału pochodzącego od kobiety i od mężczyzny i nie udaje się uzyskać czystego profilu mikrosatelitów autosomalnych. Specyficzna amplifikacja mikrosatelitów zlokalizowanych na chromosomie Y pozwala uzyskanie profilu, który można porównać z profilami podejrzanych. Wadą markerów na chromosomie Y jest to, że dziedziczą się niezmienione z ojca na syna, przez co nie można odróżnić krewnych w linii męskiej. Z tego powodu z reguły traktuje się je jako tzw. markery wykluczające. Oznacza to, że można jedynie wykluczyć podejrzanego, kiedy profile są niezgodne. 5 [ Pobierz całość w formacie PDF ] |
Podobne
|